La oxigenoterapia hiperbárica aumenta la longitud de los telómeros y disminuye la inmunosenescencia en células sanguíneas aisladas: un ensayo prospectivo orientado a revertir el proceso de envejecimiento.

laboratorio ensayo prospectivo antienvejecimiento

Traducción del ensayo publicado en la revista Aging.

Introducción

El envejecimiento de la piel puede caracterizarse por la pérdida progresiva de la integridad fisiológica, lo que resulta en funciones deterioradas y susceptibilidad a enfermedades y muerte. Este deterioro biológico se considera un factor de riesgo importante de cáncer, enfermedades cardiovasculares, diabetes y enfermedad de Alzheimer entre otras. A nivel celular, hay dos características clave del proceso de envejecimiento: acortamiento de la longitud de los telómeros y senescencia celular [ 1 ].

Los telómeros son repeticiones de nucleótidos en tándem ubicadas al final de los cromosomas que mantienen la estabilidad genómica. Los telómeros se acortan durante la replicación (mitosis) debido a la incapacidad inherente de replicar completamente la parte final de la hebra de ADN rezagada [ 2 ]. La longitud de los telómeros (TL), que mide entre 4 y 15 kilobases, se acorta gradualmente en ~ 20-40 bases por año y se asocia con diferentes enfermedades, bajo rendimiento físico y adelgazamiento cortical del cerebro [ 3 – 5 ]. Cuando la TL alcanza una longitud crítica, las células no pueden replicarse y progresar hasta la senescencia o la muerte celular programada [ 6 ]. Goglin y col. demostraron que los adultos con LT más cortos tienen mayores tasas de mortalidad [ 7]. Los LT acortados pueden ser un rasgo hereditario directo, pero varios factores ambientales también se han asociado con el acortamiento de LT, incluido el estrés, la falta de actividad de resistencia física, el índice de masa corporal excesivo, el tabaquismo, la inflamación crónica, la deficiencia de vitaminas y el estrés oxidativo [ 2 , 8 , 9 ].

La senescencia celular es una detención del ciclo celular que puede ser causada por el acortamiento de los telómeros [ 10 ], así como por otros estímulos asociados al envejecimiento independientes de TL, como el daño del ADN no telomérico [ 1 ]. El propósito principal de la senescencia es prevenir la propagación de las células dañadas activando su eliminación a través del sistema inmunológico. La acumulación de células senescentes con el envejecimiento refleja un aumento en la generación de estas células y / o una disminución en su depuración, lo que a su vez agrava el daño y contribuye al envejecimiento [ 1 ].

Un creciente cuerpo de investigación ha encontrado varios agentes farmacológicos que pueden reducir la tasa de acortamiento de los telómeros [ 11 , 12 ]. Varias intervenciones en el estilo de vida, incluido el entrenamiento de resistencia, dietas y suplementos dirigidos al metabolismo celular y al estrés oxidativo, han informado efectos relativamente pequeños (2-5%) sobre TL 3, [ 2 , 8 , 9 ].

La terapia de oxígeno hiperbárico (TOHB) utiliza oxígeno al 100% en una presión ambiental superior a una atmósfera absoluta (ATA) para mejorar la cantidad de oxígeno disuelto en los tejidos del cuerpo. Las exposiciones hiperóxicas intermitentes repetidas, usando ciertos protocolos de TOHB, pueden inducir efectos fisiológicos que normalmente ocurren durante la hipoxia en un ambiente hiperóxico, la llamada paradoja hiperóxica-hipóxica [ 13 – 16 ]. Además, recientemente se demostró que TOHB puede inducir mejoras cognitivas en adultos sanos que envejecen a través de mecanismos que implican cambios regionales en el flujo sanguíneo cerebral [ 17]. A nivel celular, se demostró que TOHB puede inducir la expresión del factor inducido por hipoxia (HIF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sirtuína (SIRT), proliferación de células madre, biogénesis mitocondrial, angiogénesis y neurogénesis [ 18 ]. Sin embargo, ningún estudio hasta la fecha ha examinado los efectos del TOHB sobre la TL y la acumulación de células senescentes.

El objetivo del presente estudio fue evaluar si el TOHB afecta la TL y la población de células T similares a la senescencia en adultos mayores.

Resultados

Treinta y cinco personas fueron asignadas a TOHB. Cinco pacientes no completaron las evaluaciones iniciales y fueron excluidos. Los 30 pacientes que completaron las evaluaciones iniciales completaron las intervenciones. Debido a la baja calidad de las muestras de sangre (bajo número de células o error técnico), cuatro pacientes fueron excluidos del análisis de telómeros y 10 pacientes del análisis de células senescentes ( Figura 1 ). Las características basales y la comparación de las cohortes después de la exclusión de los pacientes se proporcionan en la Tabla 1 . No hubo diferencias significativas entre los tres grupos ( Tabla 1 ).

Diagrama de flujo del paciente.

Figura 1. Diagrama de flujo del paciente.

Tabla 1. Características basales.

TOHAnálisis de telómerosAnálisis senescenteValor p
norte3025 (83.3%)20 (66.6%)
Años de edad)68.41±13.267.56±14.3566.70±16.000.917
IMC26.77±3.2026.89±3.3427.14±3.810.946
Males16 (53.3%)13 (52.0%)10 (50.0%)0.987
Hembras14 (47.7%)12 (48.0%)10 (50.0%)0.987
Hemograma completo
Hemoglobina6.33±1.256.57±1.156.58±1.290.707
células blancas de la sangre14.02±1.4013.92±1.3513.97±1.490.969
% PBMC39.96±6.7539.25±6.6438.59±6.630.774
Plaquetas239.87±1.39244.08±43.0254.05±41.40.559
Condiciones médicas crónicas
Fibrilación auricular4 (13.3%)4 (16.0%)2 (10.0%)0.841
Hipotiroidismo4 (13.3%)4 (16.0%)3 (15.8%)0.956
Apnea obstructiva del sueño4 (13.3%)4 (16.0%)3 (15.0%)0.961
Asma1 (3.3%)1 (4.0%)00.680
HPB7 (23.3%)5 (20.0%)6 (30.0%)0.733
ERGE3 (10%)2 (8.0%)2 (10.0%)0.961
Osteoporosis5 (16.7%)5 (20.0%)4 (20.0%)0.936
Artritis reumática1 (3.3%)01 (5.0%)0.561
Osteoartritis7 (23.3%)4 (16.0%)5 (25.0%)0.755
Diabetes mellitus3 (10%)3 (12.0%)2 (10.0%)0.966
Hipertensión7 (23.3%)5 (20.0%)5 (25.0%)0.918
Dislipidemia16 (53.3%)14 (56.0%)12 (60.0%)0.897
Enfermedad isquémica del corazón2 (6.7%)1 (4.0%)2 (10.0%)0.725
Historia de tabaquismo10 (33.3%)8 (32.0%)7 (35.0%)0.978
Medicamentos crónicos
Antiagregación8 (26.7%)6 (24.0%)5 (25.0%)0.974
Inhibidores de la ECA / bloqueadores ARB6 (20%)6 (24.0%)6 (30.0%)0.720
Bloqueadores beta5 (16.7%)5 (20.0%)3 (15.0%)0.901
Bloqueadores de calcio3 (10%)3 (12.0%)2 (10.0%)0.966
Bloqueadores alfa7 (23.3%)5 (20.0%)6 (30.0%)0.733
Diuréticos2 (6.7%)1 (4.0%)1 (5.0%)0.906
Estatinas10 (33.3%)9 (36.0%)7 (35.0%)0.978
Hipoglucemiante oral1 (3.3%)1 (4.0%)1 (5.0%)0.958
Bisfosfonatos1 (3.3%)1 (4.0%)1 (5.0%)0.958
Inhibidores de la bomba de protones3 (10%)3 (12.0%)3 (15.0%)0.726
Hormonas3 (10%)3 (12.0%)2 (10.0%)0.966
Benzodiazepinas3 (10%)2 (8.0%)1 (5.0%)0.816
ISRS5 (16.7%)5 (20.0%)3 (15.0%)0.990

Longitud del telómero

En comparación con la línea de base, las longitudes de los telómeros T-helper aumentaron significativamente en el 30 º sesión y post-TOH por 21,70 ± 40,05 (p = 0,042), 23,69% ± 39,54 (p = 0,012) y 29,30 ± 38,51 (p = 0,005 ), respectivamente ( Figura 2 ). Sin embargo, el análisis de medidas repetidas muestra una tendencia no significativa (F = 4.663, p = 0.06, Tabla 2 y Figura 2 ).

La longitud de los telómeros cambia con TOHB. Media + SEM * p

Figura 2. Cambios en la longitud de los telómeros con TOHB. Media + SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Tabla 2. Longitud de los telómeros y cambios en las células senescentes post-TOHB.

Cambios absolutosCambios relativos (%)Medidas repetidas F (p)
PBMCBase30 ª Sesión60 ª SesiónPublicar TOH30 º período de sesiones60 º período de sesionesPost-TOHB
PBMC ((N = 25)2.55±0.53-0.15±0.40-4.91±16.701,987 (t) 0,09
PBMC (N = 20)2.50±0.53-0.13±0.31-4.21±11.991.810 (t) 0.07
Longitud relativa de los telómeros (N = 25)
Asesino natural9.27±1.9111.77±5.14 (0.045)10.73±2.73 (0.013)11.75±4.22 (0.06)25.02±51.4220.56±33.3522.16±44.810.812 (0.391)
Células B8.36±2.0210.22±3.04 (0.007)11.23±3.58 (0.0001)11.17±2.98 (0.007)25.68±40.4229.39±23.3937.63±52.737.390 (0.017)
Ayudante T8.04±1.829.92±3.68 (0.042)9.63±2.17 (0.012)10.20±2.77 (0.005)21.70±40.0523.69±39.5429.30±38.514.663 (0.063)
T citotóxico8.26±1.549.83±4.08 (0.11)10.08±3.33 (0.019)10.15±2.74 (0.023)18.29±45.6224.13±40.8819.59±33.981.159 (0.310)
Células senescentes (% de células T) (N = 20)
Ayudante T10.29±5.427.84±7.09 (0.09)8.51±7.45 (0.20)6,22 ± 4,88 (< 0,0001 )-19.66±80.03-11.67±94.30-37.30±33.048.548 (0.01)
T citotóxico52.19±21.0745,53 ± 19,91 (< 0,0001 )45.45±18.81 (0.002)46.59±21.91 (0.0004)-12.21±8.74-9.81±9.50-10.96±12.596.916 (0.018)
Valores de p mostrados en () comparados con la línea de base.
Valores p en negrita <0,05.

En comparación con la línea de base, las longitudes de los telómeros de las células B aumentaron significativamente en el 30 º período de sesiones, 60 ª sesión y post-TOH por 25,68% ± 40,42 (p = 0,007), 29,39% ± 23,39 (p = 0,0001) y 37,63% ± 52,73 ( p = 0,007), respectivamente ( Figura 2 ). El análisis de medidas repetidas muestra un efecto significativo dentro del grupo (F = 0.390, p = 0.017, Tabla 2 y Figura 2 ).

En comparación con la línea de base, las longitudes de los telómeros de las células asesinas naturales aumentaron significativamente en la 30ª sesión (p = 0,045) y en la 60ª sesión en un 20,56% ± 33,35 (p = 0,013). Después de TOHB, la longitud de los telómeros aumentó en un 22,16% ± 44,81 después de TOHB (p = 0,06, Tabla 2 y Figura 2 ). El análisis de medidas repetidas indica que no hubo ningún efecto significativo adicional después de la 30ª sesión (F = 0,812, p = 0,391).

En comparación con la línea de base, las células T citotóxicas tenían un aumento no significativo en el 30 º período de sesiones por 18,29% ± 45,62 (p = 0,11), seguido por un aumento significativo de 24,13% ± 40,88 en el 60 º período de sesiones (p = 0,0019) y 19,59% ± 33,98 post-TOHB (p = 0,023). El análisis de medidas repetidas indica que no hubo ningún efecto significativo adicional después de la 30ª sesión (F = 1,159, p = 0,310, Tabla 2 y Figura 2 ).

Células senescentes

Hubo una disminución no significativa en el número de senescentes T-ayudantes en el 30 º período de sesiones y 60 º período de sesiones por -19,66% ± 80,03 (p = 0,09) y -11,67% ± 94,30 (p = 0,20), respectivamente. Sin embargo, hubo una caída significativa en el número de ayudantes T senescentes en -37,30% ± 33,04 post-TOHB (P <0,0001, Figura 3 ). El análisis de medidas repetidas mostró un efecto continuo significativo incluso después de la 30ª sesión, con un efecto dentro del grupo (F = 8.547, p = 0.01, Tabla 2 y Figura 3 ).

Cambios en las células senescentes con TOHB. Media + SEM * p

Figura 3. Cambios en las células senescentes con TOHB. Media + SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Porcentajes de células senescentes T citotóxicas disminuyeron significativamente por -12,21% ± 8,74 (P <0,0001) en el 30 º sesión TOHB, -9,81% ± 9,50 en el 60 º sesión TOHB (0.002) y -10,96% ± 12,59 (p = 0,0004 ) post-TOHB ( Tabla 2 y Figura 3 ). El análisis de medidas repetidas muestra un efecto continuo significativo incluso después de la 30ª sesión, con un efecto dentro del grupo (F = 6,916, p = 0,018, Tabla 2 ).

HIF-1alpha

Los niveles de HIF-1 alfa aumentaron de 10,54 ± 3,39 a 19,71 ± 3,39 en la 60ª sesión (p = 0,006) donde 2 semanas después de los niveles de TOHB de 16,81 ± 7,65 no fueron significativamente diferentes de la línea de base (p = 0,16).

Discusión

En este estudio, por primera vez en humanos, se encontró que las sesiones diarias repetidas de TOHB pueden aumentar la longitud de los telómeros de PBMC en más del 20% en una población que envejece, y las células B tienen el cambio más sorprendente. Además, el TOHB disminuyó el número de células senescentes en un 10-37%, siendo las células senescentes T auxiliares las más afectadas.

Se ha observado un número sustancial de asociaciones entre la longitud de los telómeros y las modificaciones del estilo de vida. Esto ha dado lugar a varios estudios intervencionistas que incluyeron dieta, suplementos (como omega-3 y nueces, entre otros), actividad física, manejo del estrés y apoyo social. Un ensayo de dos años realizado en adultos mayores cognitivamente sanos, utilizando una dieta rica en nueces, mostró una tendencia no significativa a preservar la longitud de los telómeros en comparación con una dieta de control [ 19 ]. En otro estudio que evaluó el efecto de un entrenamiento de resistencia de tipo explosivo de baja frecuencia de doce semanas en personas mayores, la longitud de los telómeros se conservó mejor en el grupo de intervención sin un aumento significativo [ 20]. Un estudio reciente encontró que el entrenamiento de resistencia aeróbica o el entrenamiento en intervalos de alta intensidad durante seis meses aumentaron la longitud de los telómeros hasta en un 5% [ 21 ]. Las técnicas adicionales de pérdida de peso, yoga y manejo del estrés no lograron mostrar cambios significativos en la longitud de los telómeros [ 22 – 25 ]. Sin embargo, la mayoría de estos estudios han mostrado correlaciones significativas entre la actividad antioxidante y la actividad de la telomerasa [ 22 – 25 ].

Si bien muchos factores genéticos y ambientales están asociados con el acortamiento de los telómeros, el mecanismo sugerido más común es el estrés oxidativo. El estrés oxidativo puede ocurrir por desequilibrios entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y eliminadores celulares. Los telómeros son muy sensibles al daño oxidativo del ADN, que puede inducir el acortamiento y la disfunción de los telómeros [ 26 ]. La asociación entre oxígeno y / o estrés oxidativo y la longitud de los telómeros se ha debatido durante las últimas décadas. Los estudios de cultivos de células humanas muestran consistentemente que el estrés oxidativo leve acelera el acortamiento de los telómeros, mientras que los antioxidantes y los captadores de radicales libres disminuyen las tasas de acortamiento y aumentan la vida útil proliferativa celular [ 27]. Varios estudios clínicos sobre afecciones patológicas (como diabetes, enfermedades inflamatorias, enfermedad de Parkinson) han mostrado correlaciones entre los marcadores de estrés oxidativo, los niveles de captadores de especies reactivas de oxígeno y la longitud de los telómeros [ 28 ]. Sin embargo, los individuos sanos no mostraron resultados similares [ 29 ].

La exposición de cultivos celulares a un entorno hiperbárico se ha sugerido previamente para inducir un estrés oxidativo significativo y la senescencia prematura de las células [ 30 ]. Sin embargo, esto se basó en células aisladas cultivadas en una incubadora hiperbárica y no en el complejo sistema biológico de los seres humanos como en este estudio. De manera similar al estudio actual, un estudio observacional prospectivo de un año en buzos expuestos a oxígeno hiperbárico intenso mostró un alargamiento significativo de los telómeros en los leucocitos [ 31 ]. Como se utiliza en el estudio actual, el protocolo TOHB utiliza los efectos inducidos por exposiciones hiperóxicas intermitentes repetidas, la llamada paradoja hipóxica hiperóxica [ 13 , 18]. Estas exposiciones hiperóxicas intermitentes inducen una respuesta adaptativa que incluye una mayor regulación positiva de los genes antioxidantes [ 32 ] y la producción de antioxidantes / depuradores que se ajustan a la mayor generación de ROS, lo que provoca que la relación ROS / depurador se vuelva gradualmente similar a la proporción en un entorno de oxígeno normal. Sin embargo, debido a que la vida media de eliminación de los carroñeros (T 1/2 ) es significativamente más larga que la T 1/2 de ROS, al volver a la normoxia, luego de exposiciones hiperóxicas repetidas, hay niveles significativamente más altos de carroñeros y una mayor actividad antioxidante [ 13 , 18]. Por lo tanto, de manera similar al ejercicio físico y la restricción calórica, un protocolo de TOHB repetido diariamente puede inducir el fenómeno de la hormesis. Las exposiciones únicas aumentan la generación de ROS de forma aguda, desencadenando la respuesta antioxidante y, con exposiciones repetidas, la respuesta se vuelve protectora [ 13 , 18 ].

Además, las exposiciones hiperóxicas intermitentes inducen muchas de las respuestas fisiológicas que se producen durante la hipoxia [ 13 ]. El TOHB induce la liberación de factores de transcripción denominados factores inducidos por hipoxia (HIF) y aumenta su estabilidad y actividad [ 14 ]. A su vez, el HIF induce una cascada celular que incluye el factor de crecimiento endotelial vascular y la inducción de la angiogénesis, la biogénesis de las mitocondrias, la movilización de células madre y el aumento de la actividad de SIRT1 [ 18 ]. Nuestro estudio confirma que el aumento de la expresión de HIF es inducido por exposiciones repetitivas de TOHB, que disminuye gradualmente hacia la normalización de los niveles de HIF en un entorno no monónico.

Actualmente, se han desarrollado en modelos animales muchas intervenciones que genéticamente o farmacológicamente (fármacos senolíticos) eliminan las células senescentes y están a la espera de evaluaciones de seguridad y eficacia en humanos [ 33 ]. El estudio actual sugiere un método no farmacológico, clínicamente disponible con un perfil de seguridad bien establecido, para la disminución de las poblaciones de células senescentes. Nuestro protocolo incluyó 60 sesiones de oxígeno al 100% a 2 ATA, incluidas tres pausas de aire durante cada sesión para utilizar la paradoja hipóxica hiperóxica y minimizar el riesgo de toxicidad por oxígeno. Curiosamente, tanto la TL como la reducción de células senescentes alcanzaron su punto máximo en el trigésimosesión. Sin embargo, la curva de respuesta a la dosis relacionada con la presión aplicada, el tiempo y el número de exposiciones de TOHB y su relación con la expresión de HIF y sus efectos regenerativos relacionados aún no se comprenden completamente y se necesitan más estudios para encontrar los protocolos de TOHB óptimos.

La oxigenoterapia hiperbárica es una modalidad de tratamiento bien establecida para heridas que no cicatrizan, lesiones por radiación, así como diferentes eventos hipóxicos o isquémicos (como toxicidad por monóxido de carbono, infecciones, etc.). En los últimos años, una creciente evidencia de ensayos clínicos y preclínicos demuestra la eficacia de TOHB para indicaciones neurológicas, incluida la pérdida auditiva neurosensorial súbita idiopática [ 34 ], después de un accidente cerebrovascular y una lesión cerebral postraumática [ 35 – 41 ], síndrome de sensibilización central como el síndrome de fibromialgia [ 42 , 43 ] y el deterioro cognitivo relacionado con la edad [ 17 ] y modelos animales de la enfermedad de Alzheimer [ 44]. Por primera vez, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto fisiológico a nivel celular en humanos que envejecen sin ninguna enfermedad funcional limitante.

Limitaciones del estudio

El estudio actual tiene varias limitaciones y fortalezas a considerar. En primer lugar, debe tenerse en cuenta el tamaño limitado de la muestra. En segundo lugar, la falta de grupo de control. Sin embargo, el estudio sugiere resultados impresionantes sobre TL y aclaramiento de células senescentes, que no se observaron en otras intervenciones. Además, los valores iniciales de longitud de los telómeros de nuestra cohorte coinciden con los valores esperados para la población que envejece [ 45 – 47]. En tercer lugar, la duración del efecto aún no se ha determinado en los seguimientos a largo plazo. En cuarto lugar, la actividad de la telomerasa no se evaluó debido al método elegido para la conservación y evaluación de la sangre. No obstante, conviene destacar varios puntos fuertes. En este estudio, CD28 se utilizó como biomarcador de células senescentes, mientras que CD57 no estaba disponible como marcador confirmatorio de senescencia de células T. Los biomarcadores se evaluaron en poblaciones de leucocitos específicos en lugar de utilizar las PBMC completas como un grupo. Se midió el efecto de TOHB aislado y se controló a los participantes para que no realizaran cambios en el estilo de vida (como nutrición y ejercicio), medicamentos o cualquier otra intervención que pudiera haber actuado como posibles factores de confusión.

En resumen, el estudio indica que TOHB puede inducir efectos senolíticos significativos, incluido un aumento significativo de la longitud de los telómeros y el aclaramiento de células senescentes en poblaciones que envejecen.

Materiales y métodos

Asignaturas

Se inscribieron treinta y cinco adultos sin deterioro cognitivo patológico, de 64 años o más, que vivían independientemente en buen estado funcional y cognitivo. El estudio se realizó entre 2016 y 2020 en el Centro Médico Shamir (Assaf-Harofeh), Israel. Los pacientes incluidos no tenían antecedentes de isquemia cardíaca o cerebrovascular durante el último año antes de la inclusión. Los criterios de exclusión incluyeron: tratamiento previo con TOHB por cualquier motivo durante los últimos tres meses, cualquier historial de malignidad durante el último año, cualquier deterioro cognitivo patológico, insuficiencia renal crónica grave (TFG <30), diabetes mellitus no controlada (HbA1C> 8, ayuno). glucosa> 200), inmunosupresores, contraindicaciones de resonancia magnética (incluido IMC> 35), tabaquismo activo o enfermedades pulmonares.

Diseño del estudio

El protocolo del estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Shamir, Israel. El estudio se realizó como un ensayo clínico prospectivo. Después de firmar un consentimiento informado y someterse a una evaluación inicial, los sujetos fueron asignados a TOHB. Los puntos de medición se evaluaron al inicio, medio punto del protocolo de tratamiento ( 30ª sesión), el día de la última sesión de TOHB y 1-2 semanas después del TOHB.

La cohorte del estudio incluyó solo a pacientes tratados con TOHB, que forma parte de una cohorte más grande de población de envejecimiento normal estudiada en el centro médico Shamir, Israel (NCT02790541 [ 17 ]).

Intervenciones

El protocolo de TOHB se administró en una cámara Multiplace Starmed-2700 (HAUX, Alemania). El protocolo constaba de 60 sesiones diarias, cinco sesiones por semana dentro de un período de tres meses. Cada sesión incluyó respirar oxígeno al 100% con una máscara a 2ATA durante 90 minutos con descansos de aire de 5 minutos cada 20 minutos. Las tasas de compresión / descompresión fueron de 1 metro / minuto. Durante el ensayo, no se permitieron cambios en el estilo de vida y la dieta, ni ajustes de medicamentos.

Muestras de sangre

Se recolectaron muestras de sangre total en tubos con EDTA utilizando una técnica estándar, al inicio del estudio, en el medio punto del protocolo de TOHB ( 30a sesión), el día de la última sesión de TOHB ( 60a sesión) y 1-2 semanas después de la última sesión de TOHB.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

La sangre completa se diluyó usando solución salina tamponada con fosfato (PBS). La separación por gradiente de densidad se realizó utilizando tubos Leucosep llenos de Lymphoprep. A continuación, los tubos se centrifugaron a 1000 xg durante 10 min a 25 ° C grados. Después de la centrifugación, las capas celulares (capa leucocitaria) se recogieron inmediatamente con una pipeta y se transfirieron a tubos de centrífuga cónicos de 50 ml, se resuspendieron con suficiente 1X PBS hasta un volumen de 50 ml y se centrifugaron a 300 xg durante 10 min a 25 ° C grados. Después de la eliminación del sobrenadante, se etiquetó cada muestra.

Longitud del telómero

Los telómeros se marcaron de acuerdo con el protocolo del kit Dako PNA / FITC (código K5327). En una suspensión de una sola célula que consta de una mezcla de PBMC (células de muestra) y la línea celular TCL 1301 (células de control), el ADN se desnaturalizó durante 10 minutos a 82 ° C en un tubo de microcentrífuga en presencia de solución de hibridación sin sonda o en solución de hibridación que contiene la sonda de telómero de PNA conjugada con fluoresceína. La hibridación tuvo lugar en la oscuridad a temperatura ambiente (TA) durante la noche. La hibridación fue seguida de dos lavados posteriores a la hibridación de 10 minutos con una solución de lavado a 40 ° C. La muestra se marcó luego con anticuerpos conjugados CD4 +, CD8 +, CD3 +, CD19 + y CD56 + en un tampón apropiado para análisis citométrico de flujo adicional [ 48 , 49]. Cada muestra se realizó por duplicado. Después del análisis de citometría de flujo, se calculó la longitud relativa de los telómeros (RTL) para CD3 + / CD4 + (T-helper), CD3 + / CD8 + (T-citotóxico), CD3 + / CD56 + (natural killer) y CD19 + (B-cells). El valor de RTL se calculó como la relación entre la señal de telómero de cada muestra y la célula de control (línea celular TCL 1301) con corrección para el índice de ADN de las células G0 / 1. Las células de la muestra y las células de control se analizaron por separado para determinar la ploidía del ADN utilizando tinción con yoduro de propidio para estandarizar el número de extremos de telómeros por célula y, por lo tanto, la longitud de los telómeros por cromosoma. Consulte la Figura 4 para ver un ejemplo de análisis FACS.

Ejemplo de análisis de datos de Flow Fish de la subpoblación T helper. Cada muestra de sangre se tiñó con la sonda de PNA (b) o sin (a), seguido de la tinción de anticuerpos (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19), antes de la adquisición de datos.

Figura 4. Ejemplo de análisis de datos de Flow Fish de la subpoblación T helper. Cada muestra de sangre se tiñó con la sonda de PNA ( b ) o sin ( a ), seguido de la tinción de anticuerpos (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19), antes de la adquisición de datos.

Inmunofenotipificación

Los porcentajes de linfocitos T nulos CD3 + CD4 + CD28 (colaboradores T senescentes) y linfocitos T nulos CD3 + CD8 + CD28 (citotóxicos T senescentes) se determinaron mediante análisis de citometría de flujo. Se tiñeron PBMC con anticuerpos anti-CD3 conjugados con VioBlue, anti-CD8 conjugados con Viogreen, anti-CD4 conjugados con PE-VIO 770A y anti-CD28 APC-VIO 770A (Miltenyi Biotec). Las células se analizaron con un citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi Biotec). Luego se calculó el porcentaje de células T CD28 nulas dentro de la población de células T CD4 + o CD8 +.

Factor inducido por hipoxia (HIF-1alpha)

La tinción de HIF1a intracelular se realizó con anticuerpo anti-HIF1a conjugado con APC o el control de isotipo correspondiente (sistemas de I + D) después de la fijación y permeabilización (Life Technologies). Las células se analizaron con un citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi Biotec) y se determinó el porcentaje de PBMC que expresaban HIF1a.

análisis estadístico

A menos que se especifique lo contrario, los datos continuos se expresaron como medias ± desviación estándar. La distribución normal de todas las variables se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se realizó un ANOVA de una vía para comparar las variables entre y dentro de los tres grupos al inicio del estudio.

Los datos categóricos se expresan en números y porcentajes y se comparan mediante pruebas de chi-cuadrado. Los análisis univariados se realizaron utilizando la prueba de Chi-Cuadrado / Exacto de Fisher para identificar variables significativas (P <0.05).

Para evaluar los efectos de TOHB, se utilizó un modelo ANOVA de medidas repetidas para probar el efecto principal dentro del sujeto. Se realizaron pruebas post hoc sobre las medias para probar las diferencias de tiempo utilizando pruebas t con una corrección de Bonferroni.

Contribuciones de autor

Todos los autores contribuyeron sustancialmente a la preparación de este manuscrito. HY, HA, ES fueron responsables del diseño del protocolo. HA, ZY, BY, ES, DKM fueron responsables del reclutamiento de pacientes. YH, AHR, SM, YY, SM, ZR, ESW, HA, DKM, SG, BGR, DG, HY, AHR, FG, LE, PN, DK, FM, ZY, BY fueron los responsables de la adquisición de datos. HY, HA. y ES fueron responsables del análisis de datos. Todos los autores interpretaron los datos. HY, HA, CM y ES escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron y finalizaron el manuscrito.

Expresiones de gratitud

Nos gustaría agradecer al Dr. Mechael Kanovsky por la edición de este manuscrito.

Conflictos de interés

AH, BY, ZY trabajan para AVIV Scientific LTD. ES es accionista de AVIV Scientific LTD.

Fondos

El estudio fue financiado por una beca de investigación de la red Sagol para la neurociencia establecida por el Sr. Sami Sagol.

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